I miei strumenti

Il microscopio ha suscitato sempre grande interesse. Tutti i libri riguardanti il settore della microscopia ne hanno parlato ampiamente, ma rinfrescare la memoria non fa mai male a nessuno......
Queste righe sono rivolte ai principianti, dato che non contengono parole tecniche quasi sempre poco comprensibili o formule analitiche che, spesso, fanno "abbassare le palpebre"!
Tralasciamo il microscopio semplice, che è costituito da una sola lente d'ingrandimento e passiamo subito ad illustrare il microscopio composto. Esso è formato da un obiettivo che può contenere fino a dieci lenti che forniscono, globalmente, una distanza focale brevissima: di un oggetto posto poco oltre il suo fuoco dà un'immagine reale ed ingrandita.
L'oculare, come l'obiettivo, è composto di più lenti, complessivamente positive, che ingrandiscono ulteriormente l'immagine fornita dall'obiettivo. Per focheggiare l'immagine si sposta, generalmente, in alto od in basso il piano di lavoro (detto anche piano porta-oggetti o piano traslatore), perchè la distanza fra obiettivo ed oculare è rigorosamente fissa in tutti i tipi di microscopio, e non è possibile variarla.
L'oggetto da osservare, chiamato preparato, è posto sopra un vetrino porta-oggetto e, a sua volta, è coperto da un altro vetrino, detto copri-oggetto, il quale ha il compito di ridurre al minimo spessore il preparato preso in esame. Questo vetrino, obbligatoriamente, deve avere lo spessore di 0,17 millimetri, nell'osservazione degli oggetti in luce bianca, per non introdurre un ulteriore cromatismo nella visione delle immagini.
I microscopi moderni sono corredati di una torretta girevole, detta anche "revolver", dove sono avvitati
diversi obiettivi a lunghezza focale variabile, in genere da 10 a 100 ingrandimenti, siglati con una X dopo il numero.
Sotto il preparato da osservare è alloggiato un complesso ottico, detto condensatore, proprio perchè raccoglie, attraverso uno specchietto posto a 45°, la luce emessa da una lampada alogena. Il condensatore, scorrendo su apposite guide che ne permettono la regolazione dal basso verso l'alto, concentra la luce sul preparato, rendendolo visibile per trasparenza. Questo sistema di illuminazione viene chiamato "campo chiaro".
In questi strumenti, allo scopo di avere una buona visione del preparato in esame, l'occhio dell'osservatore deve coincidere con l'estrazione pupillare, che è il punto esatto, in prossimità dell'ultima lente dell'oculare, nel quale si forma l'immagine reale dell'obiettivo resa dallo oculare stesso. Poichè l'estrazione pupillare è inversamente proporzionale al numero d'ingrandimenti dell'oculare conviene usare oculari a forte estrazione, anche se questi hanno minori ingrandimenti; si può sempre bilanciare l'ingrandimento totale voluto ruotando la torretta porta-obiettivi per inserirne uno con maggiori ingrandimenti.
Tutti i microscopi, da un certo livello in su, sono corredati di una torretta binoculare per osservare con entrambi gli occhi. La torretta è regolabile per la distanza interpupillare e rende la visione sicuramente più comoda, ma senza alcun effetto stereoscopico che, invece, alcuni credono di ottenere con questi tipi di microscopi. Le cose, infatti, non stanno proprio così. La luce proveniente dall'obiettivo è divisa in due fasci ottici uguali da uno "splitter", due prismi a 45° accoppiati formanti un cubo, per poi raggiungere ognuno il proprio oculare. In questo modo, la visione è più riposante, ma ognuno dei due oculari è raggiunto dal 50% della luce totale fornita dall'obiettivo e, di conseguenza, le onde luminose che raggiungono l' osservatore sono esattamente uguali a quelle di un microscopio monoculare dove si guarda con un solo occhio.
Sostituendo il condensatore con uno più specifico, si può ottenere un'immagine, detta a campo scuro, dove la luce, essendo deviata lateralmente in tutte le direzioni e distribuita come un cono intorno all'ostruzione centrale del condensatore, non raggiunge l' occhio dell'osservatore e nello stesso tempo illumina i corpuscoli da esaminare con luce obliqua, quasi radente, rendendoli visibili in maniera più evidente rispetto al campo chiaro. Sulla base delle esperienze fatte, si può affermare che questi condensatori sono di difficile uso per le osservazioni comuni e, inoltre, sono anche molto costosi. Da prove effettuate si è visto che, semplicemente spegnendo la luce sottostante il preparato ed illuminando lateralmente, all'altezza del piano di lavoro, si ottiene un'illuminazione radente che permette di ottenere un campo scuro a buon mercato, senza nulla togliere ai costosi condensatori di luce che, quasi sempre, rimangono chiusi nel cassetto, inutilizzati, data la suddetta difficoltà di impiego.
L'ingrandimento reso da un microscopio è dato dal prodotto degli ingrandimenti dell'obiettivo per quelli dell'oculare. Per esempio, se osserviamo con un obiettivo da 40x ed un oculare da 10x, vedremo l'immagine ingrandita 400x ossia quattrocento volte le dimensioni dell'oggetto osservabile ad occhio nudo. Per utilizzare alcuni obiettivi ad alto ingrandimento, è necessario porre sulpreparato alcune gocce d'olio di cedro, in modo da riuscire ad osservare con la lente
frontale dell'obiettivo immersa nel loro interno. Così facendo, si aumenta l'indice di rifrazione rispetto all'aria e, di conseguenza, anche il potere separatore.
Questo tipo di obiettivi si chiama appunto ad immersione.
Il microscopio ottico, pur essendo perfezionato sotto tutti i punti di vista, non può mai aumentare il suo potere separatore teorico. Senza entrare nel merito di complesse formule matematiche, si può semplicemente affermare che il potere separatore è la capacità di distinguere
due punti adiacenti dell'immagine. Questa capacità è ristretta entro certi limiti a causa della diffrazione della lunghezza d'onda usata e resta invariata anche aumentando gli ingrandimenti oltre un certo valore. Per esempio, a conti fatti, osservando in luce bianca, si è in grado di separare due punti distanti tra loro 1/3636 millimetri (0,2 millesimi di millimetro), mentre per lunghezze d'onda più corte, come la luce ultravioletta, si arriva a 1/4654 millimetri.
Un tipo di microscopio, detto a contrasto di fase, ci permette di evidenziare le più piccole variazioni dell'indice di rifrazione del preparato osservato. Per esempio, osservando alcuni batteri immersi in acqua e sfruttando queste piccole variazioni di rifrazione, si riesce a cogliere un alto numero di informazioni veramente utili che non sarebbe stato possibile ottenere con le altre tecniche di osservazione.
Per sfruttare appieno questo strumento, il condensatore di luce deve avere una posizione molto precisa. Infatti, agendo sulla regolazione della vite di fine corsa del condensatore stesso, fino a fargli sfiorare il vetrino che supporta il preparato, è possibile migliorare notevolmente il contrasto di fase. In questo tipo di microscopio, subito dietro l'obiettivo, è sistemata una lamina di fase che è formata da un disco di vetro ottico a facce piane e parallele, sul quale è inciso un canale anulare opaco alla radiazione luminosa, ed un condensatore di luce con un'ostruzione sempre anulare, come la lamina di fase. Inserendo un determinato obiettivo scelto per l'ingrandimento voluto, affinchè il sistema funzioni bene, si deve osservare con un particolare oculare, fornito a corredo, e sfruttando la
regolazione trasversale del condensatore, si faranno coincidere in modo preciso i due anelli sovrapponendoli. Cosa importantissima, per mantenere efficiente questo sistema a contrasto di fase, questa regolazione va ripetuta necessariamente ogni volta che si cambia obiettivo, poichè gli anelli di fase non mantengono la sovrapposizione.
Nei microscopi di questo tipo si sfasa la lunghezza d'onda di mezzo ordine di grandezza rispetto alla luce diffratta dal campione osservato e così si crea un'interferenza nelle zone a maggior indice di rifrazione, rendendole poco trasparenti. Di fatto, questi sfasamenti di luce che attraversano il preparato fanno variare la luminosità dell'immagine, rendendola visibile a sottili strati di qualche decina di angstrom (unità di misura delle lunghezze d'onda).
Il microscopio a contrasto di fase è molto utilizzato negli istituti di ricerca e da tutti i biologi in genere.
Un altro tipo di strumento molto diffuso è il microscopio stereoscopico. Esso impiega un sistema di due microscopi uniti insieme che sfruttano un solo obiettivo di dimensioni ragguardevoli, rendendo la visione dell'immagine osservabile con entrambi gli occhi, quindi comoda e stereoscopica. In altre parole, ci fa percepire la profondità dell'oggetto osservato, come una visione diretta ad occhio nudo, e si distacca molto dall'immagine piatta resa dagli altri tipi di microscopio. Un altro vantaggio di questo metodo di visione è che ad ogni oculare arriva il 100% di luce anzichè il 50% come nelle torrette binoculari, e l'immagine è più brillante, ma non si possono ottenere gli stessi ingrandimenti dei normali microscopi. Osservando in questo tipo di strumenti, ci possiamo rendere subito conto dell'elevata profondità di fuoco che possono offrire, permettendoci di vedere immagini a tre dimensioni di insetti, fiori, foglie, terricci vari e minerali di tutti i tipi, usando ingrandimenti medio-bassi.

Qualche cenno di fotografia

I microscopi stereoscopici sono molto utilizzati anche in metallurgia, proprio perchè questo tipo di strumenti lavora in luce riflessa emessa da una sorgente esterna. In apparecchi più sofisticati, l'emissione della luce è data da una sorgente anulare coassiale all'obiettivo, che permette una più precisa valutazione della qualità del campione in esame. Naturalmente, con tutti i tipi di microscopio, si possono riprendere immagini con fotocamere tradizionali oppure acquisirne con camere digitali, dove la pellicola è sostituita dagli ormai comuni CCD. Si possono, inoltre, ottenere filmati registrati su cassetta o visualizzati su un televisore con telecamere analogiche o digitali; addirittura, direttamente sul
monitor del proprio computer, utilizzando le semplici ed economiche web-cam.
Per la ripresa di foto, il sistema più facile e semplice è quello eseguito in afocale. In questo caso sia il microscopio che la macchina fotografica sono complete delle loro ottiche. Una volta focheggiato il microscopio, regolata la macchina fotografica per fuoco all'infinito ed il diaframma a piena apertura, basta appoggiare l'obiettivo della fotocamera all'anello di gomma dell'oculare, inquadrare al meglio e scattare. Questo perchè il diaframma vero e proprio è la pupilla d'uscita del microscopio e la lettura esposimetrica della macchina fotografica stabilirà il tempo di posa.
In questo modo, si possono usare anche le fotocamere digitali con eccellente profitto. Si potrà usare la tecnica, oggi sempre più diffusa, dell'elaborazione digitale al computer, sfruttando le potenzialità dei programmi di grafica. Questi ci permettono, per esempio, di cambiare con un solo click lo sfondo di un'immagine per migliorarne il contrasto e la visione d'insieme.
Prima della nascita di questa tecnica, si dovevano inserire, sopra il condensatore, filtri colorati, di gelatina o di vetro, a volte eccessivamente costosi. Mediante la computer-grafica è possibile applicare un filtro digitale, che prenda in esame tutte le linee di confine dove varia il colore e stabilire il grado di microcontrasto da applicare per aumentare la nitidezza in modo notevole. E' possibile, inoltre, correggere le dominanti di colore introdotte da un filtraggio non corretto della luce con velocità e precisione ed apportare altre innumerevoli migliorie impensabili. Si può sfruttare la tecnica digitale anche con la ripresa su pellicola a colori, facendo la scansione del negativo o della stampa per ottenere un'immagine digitale, in altre parole, scomponendola in una matrice di tanti quadratini chiamati pixel. Maggiore sarà il numero dei pixel, migliore sarà la risoluzione della foto che apparirà sul computer, ottenendo ottimi risultati anche con tale sistema.
Facendo uso di telecamere, sia analogiche che digitali, si ottiene una risoluzione più bassa limitata dal sistema televisivo. Il filmato in tempo reale, però, affascina molto e ci permette, ad esempio, di seguire in ogni istante la scissione di una cellula oppure di un paramecio che uccide senza pietà altri microrganismi, di seguire il masticamento e la digestione attraverso il suo corpo trasparente oppure l'agonia e la morte di un'alga unicellulare, perchè rimasta a secco tra il vetrino ed il copri-oggetti, e ancora innumerevoli altri organismi ed alghe viventi.
Per concludere questo breve trattato, si può aggiungere che questi filmati sono molto utili per commentarli in gruppo, ma soprattutto a scopo didattico, visto che è possibile visionarli in una scuola intorno ad un buon televisore oppure su schermi giganti in ampie sale.

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