IL POTERE RISOLUTIVO DEL MICROSCOPIO.
di Alessandro Bertoglio
Soprattutto se ci si occupa di diatomee, con le loro strutture finissime, si è sempre in cerca di un qualche miglioramento del proprio sistema ottico in modo tale da permettere una visione più precisa, più nitida e particolareggiata di quello che si ha sotto le lenti. D'altra parte, le stesse leggi fisiche pongono dei limiti invalicabili al potere risolutore di un qualsiasi sistema ottico; dunque, se da una parte è sicuramente impossibile cercare di superare tali barriere, si può sempre tentare di ottimizzare il proprio sistema e magari volgere a nostro favore le leggi fisiche che governano la formazione dell' immagine ed il potere risolvente.
Per cercare di trovare delle scappatoie e magari farci amiche le leggi della Fisica è necessario conoscerle e ragionarci un po' sopra.
Da cosa è determinato il potere risolutivo di un microscopio? Chiunque si interessi di questo strumento potrà citare la formula universalmente riconosciuta:

l l
________ ³ d ³ ________
n sin u 2n sin u

laddove "l " rappresenta la lunghezza d'onda della luce utilizzata che è di 0.546 micron se si usa la luce monocromatica verde, lunghezza d'onda alla quale l'occhio umano è molto sensibile;
"d" è il potere risolutivo del microscopio espresso in micron;
"n sin u" rappresenta una quantità chiamata apertura numerica dell'obiettivo utilizzato ed è sempre segnalata sul barilotto delle nostre ottiche;
Quest'ultima quantità dipende ancora da:
"n" ovvero l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra il coprioggetti e la lente frontale dell'ottica e vale 1 se si tratta di aria o all'incirca 1.5 se si tratta di olio per immersione;
e da "u", ovvero il semiangolo, espresso in gradi, del più ampio cono di luce, con vertice sull'oggetto osservato, che può ancora entrare nell'obiettivo e contribuire a formare l'immagine.

Questa formula, poi, esprime anche un notevole grado di variabilità del potere risolutivo in quanto, con un piccolo ragionamento matematico, si può capire che detto potere può essere pari ad una certa quantità o essere migliore di questa sino al doppio. In altre parole, usando una luce verde monocromatica ( l = 0.546 micron), ed un'ottica con apertura numerica di 1.25, cioè quella dei più comuni obiettivi ad immersione, ovvero la quantità "n sin u", il potere risolutivo potrà variare da 0.44, nel peggiore dei casi, a 0.22, sua esatta metà, nella migliore situazione. Tutto ciò è da imputarsi al numero "2" usato nel caso migliore per raddoppiare di fatto l'effetto dell'apertura numerica dell'ottica "n sin u".

La domanda che allora sorge spontanea è la seguente: perchè questa variabilità del potere risolutivo tra una quantità e la metà di questa?
La soluzione va ricercata nel tipo di luce che illumina il preparato.
Se i raggi di luce che raggiungono il preparato sono tutti perfettamente paralleli, si è dimostrato che il potere risolutore dell'obiettivo è circa la metà del massimo espresso dalla formula, ovvero il moltiplicatore che può raggiungere il fatidico "2" è pari o molto vicino ad 1.
In questo caso il potere risolvente sarà piuttosto scarso mentre si è dimostrato parimenti che il contrasto delle parti ancora risolte dell'oggetto è massimo e che questo contrasto cade molto rapidamente a zero quando si sta osservando qualche particolare al di sotto del potere risolutore calcolato per questo caso limite. In altre parole, avremo immagini molto contrastate ma scarse in risoluzione.
Detta così, questa cosa sembra piuttosto astratta ma, in effetti, la sperimentiamo spesso con il nostro microscopio. Quando chiudiamo moltissimo il diaframma di apertura del nostro condensatore, accade che noi forniamo all'oggetto sotto osservazione un cono di luce focalizzato su di esso di dimensioni angolari assi ridotte e ci avviciniamo abbastanza al caso limite dei raggi di luce perfettamente paralleli, ovvero con angolo zero. Noi tutti abbiamo sperimentato che con il diaframma molto chiuso il contrasto dell'immagine aumenta parecchio, ma parimenti ne risente pesantemente il potere risolutivo. In altre parole, in queste condizioni pratiche stiamo lavorando al limite delle condizioni più sfavorevoli espresse dalla formula del potere risolutivo del microscopio, fornendo ad esso un cono di luce molto stretto anche se non proprio di valore zero.
L'esatto contrario avviene quando apriamo il diaframma del condensatore: le immagini migliorano rapidamente in risoluzione mentre il contrasto decisamente eccessivo cala sino ad arrivare a valori piuttosto bassi quando il campo di osservazione sembra riempirsi di luce.
La teoria ha dimostrato che fornendo coni di luce via via maggiori al preparato, il potere risolutivo migliora sino al doppio, ma l'immagine perde gradatamente contrasto o, meglio, solo i particolari che sono già separabili con il cono di luce di minime dimensioni (vedi il caso peggiore descritto poco fa), mantengono quasi totalmente il loro contrasto, mentre si renderanno visibili particolari più fini ma questi verranno resi sempre meno contrastati man mano che la separazione di detti particolari si avvicina alla distanza teorica della formula nel suo caso migliore, ovvero quando il moltiplicatore si approssima al fatidico numero 2 (pur non raggiungendolo mai nella pratica).
Insomma, il potere risolutivo del microscopio dipende anche molto dal tipo di illuminazione.
Ai fini pratici, è possibile dire che un'illuminazione corretta sta alla base della bontà delle immagini che possiamo osservare e che detta illuminazione dovrà essere un buon compromesso tra un potere risolvente elevato ed un contrasto accettabile.

Da cosa dipende ancora il potere risolutivo del microscopio?

Sicuramente dalla correzione delle aberrazioni. Le aberrazioni, soprattutto le principali, ovvero la cromatica e la sferica, contribuiscono in modo rilevante alla diminuzione del contrasto dell'immagine. Come abbiamo detto poco fa, lavorando solitamente con condizioni mediane tra il caso peggiore della formula ed il migliore, avremo che i particolari più fini saranno si visibili, ma con un contrasto inferiore al reale e, quindi, già diafani e elusivi. Se a questa perdita di contrasto diciamo "fisiologica" si aggiungono le aberrazioni a diminuire ulteriormente la qualità dell'immagine, i particolari più fini perderanno quel poco di contrasto che già possedevano e diventeranno del tutto invisibili all'occhio. Insomma, un caso eclatante dove le aberrazioni possono farci perdere in potere risolvente.

Infine il potere risolutivo è condizionato dal contrasto intrinseco dei particolari osservati. Tutti noi abbiamo sperimentato almeno una volta nella vita il fatto di essere in grado di sdoppiare un paio di fili della luce di colore scuro piuttosto vicini tra loro ed a notevole distanza da noi se stagliati sul chiarore del cielo. Se gli stessi fili fossero stati bianchi, il nostro occhio non sarebbe stato in grado di mostrare la loro duplicità.
Analogo discorso vale per le immagini al microscopio: una diafana cellula non colorata presenterà contrasti molto bassi ed in definitiva il potere risolutivo del microscopio ne risentirà notevolmente, mentre la stessa cellula, colorata intensamente, grazie al contrasto migliorato di molto, renderà visibili molti più particolari.

Ricapitolando, il potere risolutivo del microscopio dipende allora dai seguenti fattori:
1) "l", la lunghezza d'onda della luce che illumina il preparato, ovvero, dimezzando tale lunghezza il potere risolutivo raddoppia (regola che viene sfruttata nei microscopi elettronici laddove si utilizzano fasci di elettroni di piccolissima lunghezza d'onda). Possiamo sfruttare tale effetto illuminando il nostro preparato con luce azzurra o violetta. Facciamo due conti: se invece della luce verde di 0.546 micron utilizzassimo luce monocromatica blu violetta (lunghezza d'onda pari a circa 0.410 micron) si otterrebbe un vantaggio del 13% e questo ammettendo che la luce verde di confronto sia anch'essa perfettamente monocromatica o, in altre parole, che alla formazione dell'immagine non contribuiscano lunghezze d'onda ancora maggiori, quali il giallo ed il rosso.
In pratica, si utilizzano filtri blu violetti molto scuri, quali il Kodak Wratten 50 ed alcuni si sono fatti costruire apposta filtri interferenziali che lasciano transitare solo fette molto ristrette nella zona del blu violetto. Il guadagno tra un'osservazione in luce integrale, dove la componente rossa e gialla dello spettro è particolarmente forte utilizzando le lampade ad incandescenza dei nostri microscopi, ed un fatta con l'ausilio di un Wratten 50 è piuttosto elevato e può raggiungere anche un buon 30% per quel che riguarda il potere risolutivo. Provare per credere, stando solo attenti ad utilizzare ottiche corrette per tali lunghezze d'onda, di solito obiettivi apocromatici, altrimenti invece di un guadagno si può andare uncontro ad un disastro.
2) "n", il mezzo interposto tra il coprioggetti e la lente frontale dell'obiettivo. Ovvero, utilizziamo ottiche ad immersione e possibilmente ad immersione in mezzo di alto indice di rifrazione. Oggi vengono praticamente prodotti solo obiettivi che possono essere utilizzati con l'olio di legno di cedro (indice all'incirca uguale a 1.5) mentre in altre epoche, forse per la mancanza di strumenti ad altissima risoluzione, leggasi microscopio elettronico, erano in voga ottiche ad immersione in fluidi con indice ancora superiore all'olio di cedro, per esempio, il monobromonaftalene, il cui uso permetteva di raggiungere aperture numeriche superiore a 1.40 che è, con pochissime eccezioni, la massima apertura numerica fornita dai migliori obiettivi oggi in commercio.
3) "u", ovvero il massimo semiangolo utile del cono di luce che l'ottica può ancora raccogliere utilmente. Ovvero, usate ottiche con apertura numerica maggiore possibile. Potrà apparire lapalissiano, ma pensiamo giovi ricordare che un'apertura numerica di 1.40 mostrerà particolari più fini di un'analoga ottica ad immersione con a.n. pari a 1.25. Di solito, poi, gli obiettivi con più alta apertura numerica risultano essere di disegno più raffinato dei loro fratelli "poveri" anche se, ovviamente, costano parecchio di più.
4) regolazione della luce che illumina il preparato. Utilizzare un costoso condensatore acromatico aplanatico con apertura numerica di 1.40 per illuminare un misero obiettivo da 20x acromatico, magari utilizzandolo con il diaframma alla massima apertura è un delitto che si sconta con il portafogli e con un abbagliamento insopportabile. Parimenti, utilizzare un'ottica apocromatica di a.n. 1.40 con un condensatore di Abbe poco o punto corretto è come mettere benzina normale in un motore da Formula 1. Per ottenere il massimo potere risolvente, l'apertura numerica del condensatore è influente quanto quella dell'obiettivo. Quindi, utilizziamo condensatori corretti e capaci di fornirci gli ampi coni di luce che i nostri obiettivi di gran pregio sono in grado di sfruttare. Ricordiamo che un condensatore, per quanto buono possa essere, se non immerso a sua volta, non sarà mai in grado di regalarci tutta l'apertura numerica di cui è capace. Lo sappiamo che è un po' noioso pulire il condensatore alla fine delle osservazioni fatte con gli obiettivi ad immersione, ma è necessario se vogliamo che le nostre ottiche rendano al massimo. Possiamo anche fare una prova, per esempio, cercando di separare una diatomea molto stretta, l'Amphipleura pellucida può fare al caso nostro; la si può rinvenire sui vetrini test oggi in commercio. Ebbene, con un buon condensatore immerso ed un buon obiettivo saremo in grado di separare le strette strie, altrimenti la cosa si farà molto ma molto ardua.
Infine, è buona norma cercare di capire se sul fascio ottico del nostro sistema di illuminazione è posto un filtro parzialmente o totalmente smerigliato. La funzione di questo accessorio è contraddittoria: da una parte rende più uniforme la luce e serve egregiamente quando desideriamo ottenere immagini esteticamente ineccepibili, da un altro lato, rende il fascio di luce molto incoerente: forse il potere puramente teorico del microscopio può aumentare di un pochino, ma il contrasto si va a far benedire ed alla fine il risultato ottenuto è una diminuzione del potere risolvente pratico.
5) la correzione delle aberrazioni. Ci sembra palese. Un'ottica scadente non raggiungerà mai le performances di una di ottima qualità anche se sul barilotto è segnalata la medesima apertura numerica. Acquistare un planapo di gran marca nuovo oggi è fuori discussione, costa quasi come un'automobile, ma sul mercato dell'usato si possono rinvenire ottiche supercorrette del medesimo tipo con aperture numeriche di 1.40 a prezzi di poco superiori al milione di vecchie lire. Fate un salto su eBay o rivolgetevi a qualche noto fornitore nazionale di ottiche e microscopi di seconda mano! Potreste anche voi diventare possessori di un'ottica dalle prestazioni pari ad una Ferrari senza firmare cambiali per una vita.
6) il contrasto dell'oggetto sotto osservazione. Provate ad osservare una diatomea montata in balsamo del Canada ed un'altra montata in Naphrax...Il contrasto che potete ottenere é tale da aumentare di oltre un buon 30% il potere risolvente del vostro microscopio!

Concludendo, possiamo affermare che, con un filtro blu scuro, un'ottica ben corretta, un'apertura numerica elevata, l'immersione del condensatore anch'esso ben corretto e regolato e, ultimo solo per citazione, l'uso di un montante ben studiato, si possono ottenere poteri separatori doppi di quelli che si avrebbero se non si badasse a tutti questi accorgimenti .... e senza spendere una fortuna !!!